BIA Separations 150.8501-1.4 CIMac™ pDNA-0.3 Analytical Column (1.4 μm)

BIA Separations 110.5118-2 CIMac PrimaS® 0.1 mL Analytical Column (2 µm)

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强大而精确的色谱分析方法是高效开发mRNA生产过程的关键。本文mRNA分析平台是BIA Separations公司PATfix™分析及纯化工作平台家族的新成员PATfix™ mRNA分析平台，可实现mRNA工艺开发（PD）和生产过程中的在线监测，尤其是IVT反应成分（核苷酸和加帽试剂）以及最终产品的表征和定量，精准针对mRNA原液制备过程中的关键环节，为mRNA药物的生产提供关键支持，帮助其加速药物的开发。

三种方法

 下面分别介绍PATfix™ mRNA分析平台三种不同的分析方法，在PATfix™ mRNA分析平台中使用三种不同的色谱柱，支持mRNA工艺开发和最终产品的表征和定量。

方法1:使用CIMac PrimaS™进行

IVT反应监测

使用CIMac PrimaS™色谱柱（货号：110.5118-2）和PATfix™平台中的方法，可以实现对IVT反应成分的全面在线分析，该方法能够定量整个IVT反应中单个核苷酸、加帽试剂和mRNA的生成（1）。该方法能够快速优化IVT反应，对mRNA的生产、规模扩大、技术转移或其他工艺开发活动至关重要。该方法对IVT主要成分的定量限（LOQ）是：核苷酸为6 ng，mRNA为12 ng。1中所示的两个mRNA洗脱峰是两种不同的mRNA异构体。

1.PrimaS色谱法分离关键的IVT成分PrimaS分析方法能够对单个核苷酸进行定量，包括以单个峰洗脱的CTP和UTP。估算UTP和CTP浓度的方法利用了这两种核苷酸在260 nm和280 nm处的紫外吸收面积之比的差异（2）。

2.CTP(1.04)和UTP(2.27)的 260/280 比值差异可用于定量PrimaS分析方法允许在线监测优化和非优化IVT条件下的反应动力学。3和4分别为通过CIMac PrimaS色谱柱分析的两组不同IVT反应条件下mRNA产生的示例。

3.非优化IVT条件下IVT反应监测，终点mRNA浓度为1.5 mg/mL

4.在优化的IVT条件下（终点mRNA浓度为7.9 mg/mL）的IVT反应监测

方法2:使用CIMac™ Oligo dT进行mRNA定量

使用CIMac™ Oligo dT（目录号：110.1219-2）和PATfix™平台中的方法，可以进行mRNA定量。CIMac™ Oligo dT是一种亲和柱，将Oligo dT连接到整体柱表面，与mRNA的聚腺苷酸尾（polyA）结合。当mRNA在洗脱步骤中洗脱时，所有没有polyA尾的其他物质（核苷酸、加帽试剂、DNA模板、酶）均在非结合条件下（流穿）洗脱。5中mRNA的LOQ值为10 ng。

5.使用Oligo dT色谱柱监测IVT样品的色谱。未结合的物质如核苷酸、质粒、加帽试剂、酶和非聚腺苷酸化的mRNA在非结合条件下被洗脱。多腺苷酸化的mRNA在洗脱步骤中被洗脱。

使用CIMac™Oligo dT的分析方法，按照EMA和FDA的指南进行了验证，是一种精确和快速的方法，可以对纯的和复杂的样品中的多腺苷酸化mRNA进行定量分析，精确度达到或高于90%（6）。

6.方法精确显示，比较测量值与标称（通过Nanodrop获得）mRNA值。使用6条不同校准曲线的数据确定误差线。

方法3:使用CIMac™ SDVB进行

mRNA完整性表征和污染物检测

CIMac™ SDVB柱是一种反相柱，与离子配对试剂一起使用。在高温下使用乙jing梯度分析的方法可以按大小进行分离（7），同时检测杂质，重点是dsRNA检测（8）。SDVB分析法对RiboRuler高范围ssRNA进行大小分离

7.CIMac SDVB色谱柱根据Thermo Scientific™ RNA High Range ladder的大小进行分离

SDVB分析法检测dsRNA杂质在最终的mRNA产物中，最关键的杂质之一是dsRNA。SDVB分析法可以单次色谱分离该杂质(8)。dsRNA的分离用J2斑点免疫印迹实验证实。

8.含有可检测含量的dsRNA的mRNA样品的色谱

SDVB分析法是一种稳定的检测mRNA的方法

mRNA的完整性可以用CIMac™ SDVB柱来研究，主峰的前沿可能表示mRNA的降解片段或来自IVT反应的转录产物。

强制降解研究（1 M NaOH，10分钟）的mRNA药物物质（4000 nt）导致了可观察到的主峰前移，这是由于在主要的、完整的mRNA之前出现了一些片段。如9所示，这些较短的片段是mRNA降解的结果。