现货促销凝胶迁移或电泳迁移率EMSA实验

2023-04-05

品牌: genelb 公司: 上海晶莱生物技术有限公司

提供商: 晶莱生物 服务名称: 凝胶迁移或电泳迁移率EMSA实验 规格: 凝胶迁移或电泳迁移率EMSA实验

产品详情请联系金山科研平台微信:jinshanbio
【晶莱生物】凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。实验步骤1. 探针的标记探针为含有与蛋白特异结合的中心盒,大约20 bp左右,使用pierce公司的3’末端标记试剂盒(PIERCE,Rockford,IL,USA)标记。操作步骤参照说明书,具体步骤如下: 1) 将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。迅速稀释TdT:Sx TdT Reaction Buffer 2 u1,超纯水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀释后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul),稀释后的TdT必须现配现用,稀释后不能保存。 2) 反应体系:5x TdT buffer 10 ul,DNA 5 pmol,Biotin-ll-UTP 5 ul,diluted TdT5 ul,超纯水补足50 ul。在37℃温浴30 min,加入2/5体积0.2 M EDTA,终止反应。加入等体积氯0仿:异戊醇(24:1)抽提TdT,涡悬充分,高速离心3 min,取上层即为标记探针,分装后-80℃保存。2. 非变性电泳 1) 非变性电泳:30%丙稀酸胺2.66 ml,TBE(5X)2 ml,10%过硫酸按1.4 ml,TEMED7 ul,双蒸水补足20 ml。按照上述配方配置4%的非变性胶。在烧杯中迅速混匀,置于冰上,灌胶,待凝胶聚合后拔出梳子,用双蒸水洗点样孔,再用0.5xTBE清洗点样孔。 2) 样品准备:按照不同的组合加入DNA和蛋白,另外还需要加入结合缓冲液,如果是粗蛋白还需要加入poly(dI.dC)(试剂盒中有)抑制非特异性条带的产生。 3) 电泳:预跑胶30-60 min,100 V。上样。跑胶,100 V,30 min左右。注意电泳要在冰上完成,以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离。 4) 转膜:电泳跑好后,将胶取下,放在大小相似的尼龙膜上,上下各加一层润湿的blotting paper,放到半干转移装置上,100 V,380 mA,转膜1 h。 5) UV交联:取出膜。在紫外交联仪中999.9 mJ,固定10 min。 6) 洗膜: a. 将Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。 b. 用20 ml of Blocking Buffer封闭膜,温浴15 min,摇床轻摇。 c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀释),配置成conjugate/blocking solution。 d. 将膜从blocking buffer中取出,在conjugate/blocking solution中轻摇15 min。 e. 将4XWash Buffer用双蒸水稀释成1 Xwash solution。 f. 将膜置于新的培养皿,用20 ml 1 Xwash solution冲洗。 g. 用1 Xwash solution洗膜4次,每次5 min,摇床轻摇。 h.在新培养皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer,将膜放入,温浴5 min,摇床轻摇。 i. 将6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于锡箔纸包好的烧杯中,摇匀,作为Substrate Working Solution。 j. 将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出,用滤纸尽量吸去液体,放入新的培养皿。 k. 将Substrate Working Solution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜,静置5min。 l. 取出膜,控制膜不能干燥。 m. 用保鲜膜将膜包好,不能有气泡。 n. 在暗室中,将膜放入曝光盒,用X-ray胶片压片,曝光时间随温度变化而不同,室温一般1 min。然后将胶片取出,经过显影,水洗和定影可以看到实验结果,如果胶片长期保存一定要在水龙头底下长时间冲洗,晾干后可拍照。客户提供:1、客户提供组织、细胞,公司提取核蛋白并进行蛋白浓度测定;2、客户提供核蛋白,公司进行蛋白浓度测定;3、客户提供已知浓度的核蛋白,公司进行EMSA实验。我们将为您提供:样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品EMSA电泳图。收费标准/服务周期/提供结果:欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。更多实验技术服务请浏览网站其他内容,或来电咨询!做实验,找晶莱!您的科研生涯,我们一路相伴!【平台项目开展范围】慢病毒,腺病毒,RNAi类,分子生物实验,病理实验,免疫学实验,细胞实验,动物实验,蛋白组学实验,芯片类实验,并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。全国统一咨询服务热线:4008-766-085【上海公司】上海市嘉定区槎溪路788弄1号17层【北京公司】北京市大兴区科创十四街嘉捷·BDA企业汇16号楼三层【长沙公司】长沙市高新区麓谷大道627号新长海中心B2-403室 【技术咨询】18500539084【公司邮箱】lab-china@genelb.cn【全国业务咨询】北京:18810244671 上海:15800916241 长沙:15616228964 武汉:15201856307 西安:13651049420 广州:18810244571 其他地区:13818286017【晶莱生物】已开展了数千个实验外包项目。我们专注于医学课题研究,已从课题申请、方案设计、试剂采购、模型构造、标本检测、数据分析、以及对SCI撰写与发表的支持,各个环节积累了数千个成功案例经验,为数千个来自临床的科研工作者解决了大量的科研问题。更多相关实验服务信息请咨询晶莱生物
© 金山科研平台 Bio-Rad伯乐官网 |伯乐授权代理 |伯乐ddPCR| 伯乐Aminex| 伯乐层析填料色谱柱是专业的授权总代理区域代理经销平台。
© 如需询价,请加客服QQ:1749072012 、客服微信:jinshanbio,或发送邮件到1749072012@qq.com
© 平台为生命科学研究相关领域提供一站式耗材试剂仪器解决方案和采购服务,数据资源基于CC协议。
© 本文地址:https://brandmillipore.cn/thread-15126.htm
产品询价需求提交
返回