Cellstain- CFSE试剂货号：C375 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate CAS号：150347-59-4 商品信息 储存条件：-20度保存 运输条件：室温 分子式：

C₂₉H₁₉NO₁₁

分子量：

557.46

特点：

● 可用于细胞增殖检测

● 长效荧光染色，最长三周可见

● 可用于流式细胞仪检测

选择规格： 1mg

凑单关联产品TOP5

NO.1. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit细胞凋亡检测

NO.2. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit细胞凋亡检测

NO.3. Calcein-AM细胞质染色

NO.4. Cell Viability Assay Kit细胞增殖/毒性检测

NO.5. FerroOrange细胞亚铁离子检测

规格性状

规格

特性：该产物为无色至微黄色固体，可溶于二甲基亚砜和乙腈。

可溶于二甲基亚砜：试验成功

NMR光谱：试验成功

产品概述

荧光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE 是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFSE在结构上将酚羟基部位改造成 AM 体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的 CFSE 的 AM 部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。CFSE 的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE 进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。

在细胞分裂增殖过程中，CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。另外，CFSE 标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。有报道证实 CFSE 毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

原理

荧光特性

荧光波长：λex=496 nm, λem=516 nm

操作说明

＊建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、CFSE的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。

配制试剂：

1、从冰箱中取出CFSE试剂，放至室温后再打开。盛放CFSE的管子开盖前请轻弹管壁几次，让粉末充分落入管底，必要时可采用离心的方法。

2、取0.9 ml DMSO^a)加到CFSE管中溶解，配制成2 mM的CFSE母液^b)（加入DMSO后请先盖上盖子，反复颠倒把盖子和管壁上的试剂洗到底部，并用移液器反复吹打使溶解完全）。

3、用PBS(-)或适当的缓冲液将其稀释成100 μM或其它浓度（如果采用载玻片观察法，建议浓度为20 μM的工作液^c))。

a) DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

b) 由于CFSE母液遇水极易分解，所以建议分装保存，例如分装成5 μl/管。

方法：分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。

c) CFSE工作液应现配现用，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。

* PBS(-)：不含钙和镁离子的PBS。

细胞染色(仅供参考)：

例1 培养板观察法

1、准备细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基^a)调整细胞浓度至约10⁷个／ml。

2、取1ml细胞悬液至试管中，加入适量CFSE工作液，轻轻搅拌混匀（建议CFSE的终浓度参考相关论文或做个预实验：分别设定终浓度为0.5,1,2,5,10,20 μM…,以确定最佳染色浓度^b)）。

3、在37℃培养箱中培养15-30分钟。

4、离心后去上清，加入2 ml PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

5、加入合适的培养基制成细胞悬液。

6、取500 μl的细胞悬液加在培养孔中，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量^c)进行实验。

例2载玻片观察法

1、准备1 ml细胞悬液，用PBS(-)等合适的培养基^a)调整细胞浓度至约10⁷个／ml。

2、取30 μl细胞悬液至试管中，加入10 μl浓度为20 μM的CFSE工作液（终浓度为5μM），轻轻搅拌混匀^b)。

3、在37℃培养箱中培养15-30分钟。

4、滴10 μl的细胞悬液在载玻片上，用荧光显微镜观察，看到荧光后，根据自己实验的要求调整细胞数量^C)进行实验。

＊如果背景高的话，第3步之后需要洗去多余的CFSE：

离心后去上清，加入90 μl PBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。

a)尽可能用不含血清的培养基，血清中的酶和蛋白质会分解CFSE，可能会影响染色效果。

b)如果荧光强度弱，可以适当提高CFSE的终浓度。如果细胞毒性大或背景太高，可以适当降低CFSE的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

c)根据不同的实验目的和要求，采用稀释的方法调整细胞数量。

文献

1) M. Bronner-Fraser, “Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion”,J. Cell Biol.,1985,101, 610.

2) A. Nose and M. Takeichi, “A Novel Cadherin Cell Adhesion Molecule:Its Expression Patterns Associated WithImplantation and Organogenesis of Mouse Embryos”,J. Cell Biol.,1986,103, 2649.

3) S. A. Weston and C. R. Parish, “New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”,J. Immunol. Methods,1990,133, 87.

4) C. K. Raymond, P. J. O’hara, G. Eichinger, J. H. Rothman and T. H. Stevens, “Molecular Analysis of the Yeast VPS3 Gene and the Role of Its Product in Vacuolar Protein Sorting and Vacuolar Segregation during the Cell Cycle”,J. Cell Biol.,1990,111, 877.

5) G. Radcliff, R. Waite, J. Lefevre, M. D. Poulik and D. M. Callewaert, “Quantification of Effector/Target Conjugation Involving Natural Killer(NK) or Lymphokine Activated Killer(LAK) Cells by Two-color Flow Cytometry”,J. Immunol. Methods,1991,139, 281.

6) S. A. Weston and C. R. Parish, “Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13, 739.

7) L. S. D. Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, “Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”,J. Immunol. Methods,1994,172, 115.

常见问题Q&A

Q1请告诉我如何使用CFSE。

A1：参考文献[1]中的描述如下所示。 杀死7-10周大的CBA / H小鼠，去除脾脏（或其他目标器官），然后浸入F15培养基（1％FCS）中。 然后，通过金属网获得细胞悬液，并通过离心除去红细胞，死细胞等。 将纯化的淋巴细胞悬浮在pH 7.0的PBS中至50,000,000细胞/ mL。 加入5.0μM浓度的CFSE，并在37°C下标记15分钟。悬浮在冰冷却的F15培养基（1％FCS）中并离心 用（350g，5分钟，20℃）洗涤两次。悬浮在F15培养基中。 静脉注射到CBA / H小鼠中。一定时间后，杀死鼠标并去除脾脏（或其他目标器官）。 切除淋巴细胞并分离并通过流式细胞仪分析。 参考文献[2]是关于钙黄绿素-AM的，但也通过与[1]相同的步骤将其与CFSE进行了比较。 【参考文献】 1. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, J. Immunol. Methods, 133, 87 (1990). 2. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, Cytometry, 13, 739 (1992).

Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。

A2：

Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留？

A3: “就细胞内保留而言，“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低，但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90％” ・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990) ・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)” 但是，“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。 ・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994) 还要注意的一点是，原始的基本骨架是荧光素，因此由于激发光而褪色由于容易发生，因此可能难以通过长期激发来观察荧光。 （尽管最好使用防褪色剂等）