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小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管
在实验中,我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比,更简易,而且适合没有经验的实验操作员。
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◆材料
1. 假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)
2. 微型弹簧剪刀(5mm刀片)
3. 钳子(Pair of watchmaker's #5 forceps)
4. 动脉夹
5. 伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)
→clip applicator
6. 塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)
7. 用于胚胎的移植和操作的玻璃微管
◆步骤
准备小鼠
1. 麻醉一只雌性小鼠。
2. 常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。
3. 用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪
定位输卵管
如下图所示,通过切割输卵管,往切口处插入微管,然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。
但是,正如我们所看到的输卵管的图示(A),小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且,微管是从上方插入的,胚胎难以到达输卵管的壶腹部。
为了简化此过程,在操作前,可以通过动脉夹来改变输卵管的定位,如图(B)。
1. 立体显微镜下观察输卵管,并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置,或者改变动脉夹的位置。
2. 通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。
注意:因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样,需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。 注意:如果你是左撇子,就能轻易地完成定位输卵管的步骤。
胚胎与玻璃微管的制备
1. 在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡),然后在滴液里放入20个胚胎。
2. 制作转移胚胎的玻璃微管,管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。
注意:如上图所示,当玻璃微管首次插入滴液时,液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎,以免吸入液体石蜡。
有证据表明,如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。
转移胚胎
1. 使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀,解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。
2. 将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处,朝壶腹部注入胚胎。
3. 用钳子固定微管插入的输卵管的位置。
4. 排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。
注意:如果实验进程顺利,你可以通过壶腹部的壁看到气泡。
注意:如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管,稍微往后移动玻璃微管,再次尝试。
5. 将切口处的微管移走。
注意:调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管,就能更容易地插入输卵管内。
6. 把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部,用伤口缝合器缝合伤口。
7. 重复上述步骤,把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。
8. 在37°C 加热板上保持小鼠的体温,直到小鼠苏醒。
参考文献
【1】 Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.
【2】 Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A
Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.
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